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        鄰近蛋白標記服務

        1、鄰近標記技術簡介
        鄰近標記技術(Proximity labeling, PL)是與靶蛋白(POI)融合表達的標記酶(例如APEX2,TurboID等)在融合蛋白附近空間區域將與POI瞬時或持續互作的蛋白進行生物標記。該生物標記是將已知的反應基團,如生物素(Biotin),共價連接到融合蛋白鄰近的蛋白質上。然后利用反應基團的純化方式捕捉POI的互作蛋白。該技術可捕獲大量與POI存在瞬時或弱互作的蛋白。鄰近標記技術原理如Fig.1所示。

        Fig.1 鄰近蛋白標記技術原理

         

        2、鄰近標記體系選擇
        2.1 APEX2體系:APEX2是在APEX (Ascorbate Peroxidase:抗壞血酸過氧化物酶)基因的基礎上進一步工程改造而來。在H2O2存在的情況下,APEX2在1 min內能快速將生物素基酪氨酰胺(Biotin-tyramide,Biotin-phenol)、生物素-4-氨基苯酚(Biotin-4-aminophenol)或生物素-萘胺(Biotin-Naphthylamine, Biotin-Nap)轉化為自由基,這些自由基可以標記20 nm半徑內無論是直接相互作用的蛋白還是鄰近的蛋白任意暴露在外富含電子的氨基酸殘基(Tyr, Trp, Cys or His),后續可通過Streptavidin磁珠或凝膠從細胞裂解液中分離純化生物素標記蛋白,然后通過質譜(Mass spectrometry, MS)鑒定相互作用的蛋白。
        2.2 miniTurboID體系: miniTurboID是在E.coli生物素連接酶人工改造獲得的TurboID的基礎上進一步截短、突變得到的新型生物素連接酶。miniTurboID分子量約28 kDa,因此miniTurboID對融合蛋白功能的影響更小,空間位阻也更小,更容易接近被標記蛋白并產生更好的標記效果?晒┻x擇的兩套標記體系如下:

         

        APEX2 系統

        TurboID 系統

        pLenti-CMV-MCS·(G4S)3·APEX2·FLAG-EF1a-Puro

        pLenti-CMV-MCS·(G4S)3·TurboID·FLAG-EF1a-Puro

        pLenti-CMV-FLAG·APEX2·(G4S)3·MCS-EF1a-Puro

        pLenti-CMV-FLAG·TurboID·(G4S)3·MCS-EF1a-Puro


        3、鄰近蛋白標記技術的優勢
        ① 在活細胞中捕獲與誘餌蛋白互作的蛋白;
        ② 利用生物素與鏈霉親和素的高親和力篩選更多互作的蛋白;
        ③ 靈敏度高,可捕獲作用力弱和瞬時互作的蛋白。


        4、技術流程:

        維根生物的鄰近蛋白標記服務流程如Fig.2所示。
        Fig.2 鄰近蛋白標記技術流程


        5、服務周期:
        根據細胞生長特性與基因不同,服務周期在8~10周;


        6、客戶提供:
        靶細胞及其培養方案;
        誘餌蛋白信息


        7、交付標準:
        ① 蛋白洗脫液銀染膠圖;
        ② 質譜分析數據.

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